细胞凋亡实验流程及注意事项

一、实验者目的

1、掌屋细胞死亡蛋白质的形态相似性 2、总会用白光探针对蛋白质同步进行双标记来检测长时间来时蛋白质、细胞死亡蛋白质和肿胀蛋白质的方法

二、实验者数学模型

蛋白质死亡根据其性质、更早及生功用学意义差别于为细胞死亡和肿胀两种有所不同类型。细胞死亡特别是在于生命界，在生功用个棒状和生存里起着非常极为重要的作用。它是蛋白质在一定生理有条件下一系列顺序发生事件真相的组合，是蛋白质遵循一定规律自己告一段落生命的自主控制过程。蛋白质细胞死亡具有可鉴别的形态学和生功用化学相似性。

在形态上可见细胞死亡蛋白质与周围蛋白质脱离认识，蛋白质变园，蛋白质膜向内皱缩、粘液浓缩、内质网蚕食、蛋白质质子固缩撕裂深褐色团疏松或新月状特有种、内质网和蛋白质膜进一步融汇将蛋白质分成多个清晰包裹的细胞死亡小棒状，细胞死亡小棒状最后被复来时蛋白质复来时消化。在细胞死亡过程里蛋白质细节功用并不释放到蛋白质部份，不会严重影响其它蛋白质，因而不招致上皮细胞加成。

在生功用化学上，多数蛋白质细胞死亡的过程里，内源性蛋白质内切激酶来时化，来时性增加。质子DNA随机地在质子小棒状的连接口部被激酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种早先。如果对质子DNA同步进行琼脂糖溶胶，可显示以180-200bp为可有的DNA ladder（梯状带纹）的相似性。

相比之下，肿胀是蛋白质正处于更为严重破损有条件下发生的蛋白质死亡。蛋白质在肿胀早期即完全恢复质膜清晰性，各种微管膨胀，进而质膜崩解释放出其里的细节功用，招致上皮细胞加成，肿胀过程里蛋白质质子DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA早先，不能形成梯状带纹，而深褐色强磁场状。

一些温和的破损焦虑及一些效药功用可游离蛋白质细胞死亡，通常这些因素在游离细胞死亡的同时，也可产生蛋白质肿胀，这由此而来决于破损的更为严重总体和蛋白质本身对焦虑的敏感总体。

三尖杉甲基硫（HT）是而今再行研制的一种对急性粒蛋白质白血病，急性单质子白血病等有良好的效药功用。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2同一等待时间，即可游离HL-60蛋白质细胞死亡，并表现出典型的细胞死亡相似性。本实验者用1μg/ml HT在棒状部份游离培训的HL-60蛋白质发生细胞死亡，同时也有少数蛋白质发生肿胀。用Hoechst33342和钴丙啶（propidium iodide，PI）对蛋白质同步进行双重颜料，可以差别细胞死亡、肿胀及长时间蛋白质。

蛋白质膜是一选择性的遗传功用质，一般的生功用颜料如PI等不能穿过质膜。当蛋白质肿胀时，质膜不清晰，PI就转回蛋白质内部，它可嵌入到DNA或RNA里，使肿胀蛋白质着色，细胞死亡蛋白质和来时蛋白质不着色。而一些来时蛋白质颜料由于为亲脂性功用质，可跨膜转回来时蛋白质，因而可同步进行来时蛋白质颜料。Hoechst33342是一种来时性白光颜料且有毒要强，它是双苯并咪唑的一种衍生功用。与DNA特异结合（主要结合于A-T）残基区），显示细胞死亡蛋白质和来时蛋白质。凡是看不到有细胞死亡小棒状的蛋白质都是细胞死亡蛋白质。

三、实验者用品

1、试剂：三尖杉甲基硫（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTAPH、水溶性氢化液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE溶胶PH，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 2、仪器设备：白光光学，溶胶仪，溶胶槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。

四、实验者材料

人早幼粒白血病HL-60蛋白质，用含10%小牛血清的RPMI1640培训基在37℃，5%CO2有条件下培训。

五、方法步骤

1、三尖杉甲基硫其会HL-60蛋白质细胞死亡 （1）实验者前约24同一等待时间，疫苗接种两酒杯HL-60蛋白质，标记①、②，每酒杯含约6ml培训液，徙37℃，5%CO2培训箱培训。 （2）实验者前约2.5同一等待时间，当蛋白质表面积达到70%，①号酒杯转为三尖杉甲基硫200μl，使终ppm为1μg/ml，②号酒杯里转为同等量PBS（pH7.4）作相异。协同填入培训箱里在此之后培训2.5同一等待时间。

2、Ho33342和PI双重颜料鉴别三种蛋白质 （1）颜料：将酒杯里的蛋白质摇匀由此而来200μl于1.5ml的离心管里，转为Ho33342母液2μl，PI 20μl，颜料15分钟。 （2）滴片：由此而来一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管里各由此而来以上颜料后的蛋白质悬液10μl，转为小户外盖上盖玻片，白光镜下用紫部份激发光，高倍镜下观察，差别三种蛋白质，并注意三者数量。

六、需注意

1、游离培训HL-60蛋白质等待时间要准确； 2、白光光学下观察蛋白质时，由于白光易碎兴兵，观察时要尽量短时间。